城市生活污水抗生素抗性基因污染研究
隨著我國(guó)新型城鎮(zhèn)化的不斷推進(jìn)以及城市人口的持續(xù)增加，城市生活污水和生活垃圾的產(chǎn)生量也不斷增加.城市生活污水和生活垃圾填埋場(chǎng)產(chǎn)生的垃圾滲濾液是城市環(huán)境保護(hù)工作的重點(diǎn)和難點(diǎn).抗生素在養(yǎng)殖、醫(yī)療保健等行業(yè)被廣泛使用，并存在著過(guò)度使用、長(zhǎng)期濫用等現(xiàn)象，并且產(chǎn)生了嚴(yán)重的環(huán)境抗生素抗性的問(wèn)題，抗生素抗性基因在環(huán)境中不斷傳播與富集，嚴(yán)重危害人類(lèi)健康與環(huán)境安全.各種環(huán)境介質(zhì)中，包括豬場(chǎng)土壤[1, 2]、污泥堆肥[3, 4]、城市河流水體[5]、施用豬糞水稻土[6]，甚至自來(lái)水[7, 8]中也檢測(cè)出環(huán)境抗生素抗性基因，環(huán)境抗生素抗性基因研究取得了一些進(jìn)展[9]. Pruden等[10]2006年首次提出將抗生素抗性基因作為一種新型環(huán)境污染物，逐漸引起全球科學(xué)家和公眾的高度關(guān)注.
城市生活污水主要是指城市生活中的各種餐廚污水、垃圾、糞便、洗滌劑等各種污染水體形成的混合污水，氮、磷、硫等營(yíng)養(yǎng)元素含量較高，微生物含量高，并且含有病原微生物[11, 12].生活垃圾填埋場(chǎng)是城市生活垃圾、污水廠的處置污泥、電子廢棄物、垃圾焚燒廠飛灰殘?jiān)裙腆w廢棄物的主要最終堆放場(chǎng)所.垃圾滲濾液是伴隨垃圾填埋場(chǎng)運(yùn)營(yíng)整個(gè)生命周期的“二次污染物”.生活垃圾滲濾液具有污染物成分復(fù)雜，污染物濃度高的特點(diǎn)，相較于城市生活污水，其高濃度的氨氮、有毒有害物質(zhì)，重金屬離子等特征形成了一個(gè)特殊環(huán)境，尤其是場(chǎng)齡大于5 a的垃圾滲濾液可生化性差[13].受人類(lèi)生產(chǎn)生活的影響，城市生活污水和垃圾滲濾液中含有抗生素殘留以及抗生素抗性的微生物，被認(rèn)為是環(huán)境抗生素抗性的一個(gè)重要存儲(chǔ)庫(kù)[14~16].
由于垃圾滲濾深度處理后產(chǎn)生了難以處理的濃縮液，垃圾滲濾液(包括濃縮液)往往被運(yùn)送到城市生活污水處理廠進(jìn)行合并處理[13, 17].目前，城市生活污水處理過(guò)程中的抗生素抗性基因污染分布及演變有較多相關(guān)研究[18, 19]，并且主要是針對(duì)磺胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)等少數(shù)幾種抗生素抗性基因.針對(duì)城市生活污水(接收垃圾滲濾液進(jìn)行合并處理)和生活垃圾滲濾液環(huán)境抗生素抗性的對(duì)比研究，從抗生素抗性譜的角度全面研究這兩者間的抗性基因污染還沒(méi)有或者比較少相關(guān)研究報(bào)道.因此，對(duì)城市生活污水和生活垃圾滲濾液中抗生素抗性種類(lèi)、分布格局開(kāi)展對(duì)比研究，比較兩者之間的異同，綜合分析研究城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因污染狀況，對(duì)于加強(qiáng)城市生活污水和垃圾滲濾液管理與處置，評(píng)估兩者的生態(tài)安全情勢(shì)和環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)顯得十分必要.
1 材料與方法
1.1 樣品采集及前處理
城市生活污水樣品于2015年7月采集自廈門(mén)市某污水處理廠(接收廈門(mén)市東部固廢處理中心生活垃圾填埋場(chǎng)部分的垃圾滲濾液和垃圾滲濾液處置后濃縮液)的進(jìn)水樣品1 L(3個(gè)采樣平行樣品)，其中添加了終濃度為50%乙醇進(jìn)行預(yù)處理，用于固定污水中微生物.生活垃圾滲濾液采樣地點(diǎn)位于廈門(mén)市東部固廢處理中心生活垃圾填埋場(chǎng)，于2015年7月采集了垃圾滲濾液調(diào)節(jié)池末端，也是滲濾液處理站污水進(jìn)口端樣品1 L(3個(gè)采樣平行樣品)，同樣在采集樣品中添加了乙醇進(jìn)行預(yù)處理.所采集的城市生活污水和生活垃圾滲濾液，存放在低溫采樣箱中并迅速轉(zhuǎn)移至實(shí)驗(yàn)室的-20℃冰箱中保存，用于環(huán)境樣品的DNA提取.
1.2 城市生活污水和生活垃圾滲濾液DNA提取
量取城市生活污水(raw wastewater，RWW)和生活垃圾滲濾液(raw leachate，RLC)各40 mL，分裝到50 mL離心管中，使用12 000 r ·min-1轉(zhuǎn)速離心10 min，倒掉上清液，每個(gè)離心管中再加入1 mL生理鹽水，振蕩并懸浮起離心管底部固體，從而達(dá)到清洗效果.再將離心管中的全部樣品分別轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL離心管中，18 000 r ·min-1轉(zhuǎn)速離心后，棄去上清液.然后加入FastDNA? Spin Kit for Soil試劑盒(MP Biomedicals，美國(guó))中的PBS緩沖液(978 μL).
隨后將上述含有采集樣品的PBS緩沖液轉(zhuǎn)移至試劑盒中的Lysing Matrix E tube，按照生產(chǎn)商提供的方法提取樣品中的總DNA，然后用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳驗(yàn)證.樣品所提取的DNA樣品用QuantiFluor? dsDNA System(Promega Corporation，美國(guó))試劑盒測(cè)定雙鏈DNA濃度.根據(jù)測(cè)定的樣品DNA濃度，實(shí)驗(yàn)樣品用滅菌的超純水統(tǒng)一稀釋至50 ng ·μL-1.
1.3 高通量熒光定量PCR
采用SmartChip Real-Time PCR Systems(WaferGen Inc.，美國(guó))高通量熒光定量反應(yīng)平臺(tái).研究中所采用的293對(duì)引物在先前的相關(guān)的研究中被有效驗(yàn)證過(guò)[1].此外另外添加了1對(duì)用于檢定超級(jí)細(xì)菌抗生素抗性基因blaNDM-1的引物[20]，1對(duì)intI 1 整合子基因(class1 integron)引物[21]和1對(duì)CintI 1臨床醫(yī)學(xué)意義上的整合子基因(clinical class 1 integon)引物[22].
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的體積為100 nL.反應(yīng)體系中各試劑的終濃度為： 1×的LightCycler 480 SYBR? Green ⅠMaster Mix(Roche，美國(guó)), nuclease-free PCR-grade water，1 ng ·μL-1的BSA，5 ng ·μL-1的DNA模板，1 μmol ·L-1的上下游引物. PCR反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性10 min;95℃變性30 s，60℃退火延伸30 s，總共40個(gè)循環(huán);儀器程序自動(dòng)升溫進(jìn)行熔解曲線(xiàn)分析.高通量定量PCR每個(gè)芯片都有不添加DNA模板的陰性對(duì)照. qPCR反應(yīng)得到的數(shù)據(jù)通過(guò)Cycler預(yù)設(shè)定的篩選條件(擴(kuò)增效率介于1.8~2.2)進(jìn)行導(dǎo)出.根據(jù)SmartChip Real-Time PCR Systems的靈敏度和精確度，確定循環(huán)次數(shù)CT值為31時(shí)作為儀器的檢測(cè)限.每個(gè)樣品都進(jìn)行3次技術(shù)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，當(dāng)3次技術(shù)重復(fù)都被擴(kuò)增出來(lái)時(shí)認(rèn)為是陽(yáng)性擴(kuò)增，3個(gè)采樣平行樣品都是陽(yáng)性擴(kuò)增時(shí)，認(rèn)為樣品的目的基因被有效檢出.
1.4 數(shù)據(jù)分析
基因的相對(duì)拷貝數(shù)(gene relative copy number)參照Looft等[23]的研究，用公式(1)進(jìn)行估算.根據(jù)Schmittgen等[24]關(guān)于相對(duì)定量分析方法，用FC(fold change)值，采用公式(2)來(lái)計(jì)算表征相對(duì)于城市生活污水對(duì)照樣品，生活垃圾滲濾液的抗生素抗性的富集或者衰減狀況.
(1)
(2)
式中，CT是PCR反應(yīng)收集到特定熒光時(shí)的循環(huán)次數(shù)，ARG代表抗生素抗性基因，16S是代表 16SrDNA基因，Target是環(huán)境實(shí)驗(yàn)樣品，Ref是對(duì)照樣品，F(xiàn)C是ARGs拷貝數(shù)的富集或衰減程度.當(dāng)FC=2[-(ΔΔCT+2 s)]>1時(shí)，且student t檢驗(yàn)具有顯著性時(shí)，認(rèn)為環(huán)境實(shí)驗(yàn)樣品相對(duì)于對(duì)照樣品顯著富集.
2 結(jié)果與討論 2.1 城市生活污水和垃圾滲濾液中抗生素抗性基因的多樣性
根據(jù)實(shí)驗(yàn)中使用的296對(duì)引物，按照基因?qū)?yīng)抗生素類(lèi)型分為氨基糖苷類(lèi)抗生素(Aminoglycoside)、 β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素(β-Lactamase)、氯霉素類(lèi)抗生素(Chloramphenicol)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)-林肯酰胺類(lèi)-鏈陽(yáng)性菌素B類(lèi)抗生素(MLSB)、磺胺類(lèi)抗生素(Sulfonamide)、四環(huán)素類(lèi)抗生素(Tetracycline)、萬(wàn)古霉素類(lèi)抗生素(Vancomycin)和其他類(lèi)或者發(fā)揮外排泵作用(other/efflux)這8類(lèi)抗生素抗性基因.城市生活污水(RWW)檢測(cè)出187抗生素抗性基因，垃圾滲濾液檢測(cè)出39中抗生素抗性基因(圖 1).其中，城市生活污水檢測(cè)到的抗生素抗性基因涵蓋了以上全部8類(lèi)抗生素類(lèi)型，而垃圾滲濾液檢測(cè)到的抗性基因類(lèi)型只含有氨基糖苷類(lèi)抗生素(Aminoglycoside)、大環(huán)內(nèi)脂類(lèi)-林肯酰胺類(lèi)-鏈陽(yáng)性菌素B類(lèi)抗生素(MLSB)、四環(huán)素類(lèi)抗生素(Tetracycline)和其它類(lèi)或者發(fā)揮外排泵作用(other/efflux)這4類(lèi)抗生素抗性類(lèi)型.有研究表明，垃圾滲濾液中四環(huán)素類(lèi)抗生素類(lèi)型在中國(guó)6個(gè)不同地理位置的垃圾填埋場(chǎng)滲濾液中被有效檢出[25, 26]，與本研究結(jié)果一致.此外，垃圾滲濾液檢測(cè)到的4類(lèi)抗生素抗性類(lèi)型中的抗性基因數(shù)目均小于生活污水中的對(duì)應(yīng)類(lèi)型抗性基因數(shù)目.抗生素抗性基因按照抗性機(jī)制可以分成抗生素失活(deactivation)、外排泵作用機(jī)制(efflux)、核糖體保護(hù)機(jī)制(protection)和未知抗性機(jī)制(unkown)四大類(lèi).將檢測(cè)到的抗生素抗性基因從抗生素抗性機(jī)制歸類(lèi)分析，抗生素失活(deactivation)是兩種污水微生物抗生素抗性最主要機(jī)制，比例分別為48.13%和51.28%(圖 2).垃圾滲濾液檢測(cè)到的39種抗生素抗性基因中只有erm(35)基因僅在垃圾滲濾液中檢出，其余38種抗性基因在城市生活污水同時(shí)被有效檢出.總體結(jié)果表明，城市生活污水和垃圾滲濾液檢測(cè)到的抗生素抗性種類(lèi)有顯著差異(P < 0.05).
圖 1 檢測(cè)到的抗生素抗性基因種類(lèi)數(shù)
圖 2 抗生素抗性機(jī)制的相對(duì)比例
2.2 抗生素抗性基因在城市生活污水和垃圾滲濾液中的污染分布格局
主成分分析表明，城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因結(jié)構(gòu)不同，PCA1解釋了抗性基因結(jié)構(gòu)變化的98.8%，城市生活污水和垃圾滲濾液抗性基因沿第一軸分為兩個(gè)簇，表明抗生素抗性基因在兩種城市污水有著不同的分布格局(圖 3).城市生活污水抗生素抗性基因分布相較于垃圾滲濾液更具有一致性.
圖 3 城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因多樣性主成分分析
Auerbach等[27]的研究表明，城市生活污水(污水處理廠進(jìn)水)四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因的豐度高達(dá)109 copies ·L-1數(shù)量級(jí).相較于垃圾滲濾液，熱圖分析表明(圖 4)，城市生活污水的抗生素抗性基因豐度和多樣性均顯著大于垃圾滲濾液(P < 0.05). 圖 4中A簇代表抗生素抗性基因在城市生活污水和垃圾滲濾液中均有檢出，主要類(lèi)型是氨基糖苷類(lèi)和四環(huán)素類(lèi)抗生素抗性基因，并且A1簇的抗生素抗性相對(duì)于A2簇顯著富集. B簇和C簇中的抗生素抗性基因僅在城市污水中檢出，垃圾滲濾液中未檢出(D簇)，并且抗生素抗性潛在表達(dá)強(qiáng)度B簇大于C簇.垃圾滲濾液是垃圾填埋體產(chǎn)生的“二次污染物”[28]，運(yùn)營(yíng)時(shí)間5 a以上的垃圾填埋場(chǎng)產(chǎn)生的垃圾滲濾液含有多種有毒有害物質(zhì)，并且氨氮濃度高，可生化性差[13]，高通量定量PCR結(jié)果表明垃圾滲濾液抗生素抗性類(lèi)型和抗性基因豐度低于城市生活污水，熱圖分析總體結(jié)果顯示，城市生活污水和生活垃圾滲濾液抗性基因污染分布格局顯著不同.
圖 4 城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因污染分布格局
2.3 抗生素抗性基因豐度與城市生活污水抗性基因的富集
廣州、福州等地的污水廠接納當(dāng)?shù)厣罾盥駡?chǎng)垃圾滲濾液進(jìn)行合并處理，普通生活污水處理廠承擔(dān)部分垃圾滲濾液的處理任務(wù)已經(jīng)成為垃圾滲濾液處理的“新常態(tài)”，實(shí)踐證明是一種經(jīng)濟(jì)有效的方式[13, 17].本研究中采集的城市生活污水樣品中含有一定量的垃圾滲濾液(濃縮液)，因此可以將垃圾滲濾液作為對(duì)照樣品，研究抗生素抗性基因的在這兩種城市污水的異同.根據(jù)Schmittgen等[24]關(guān)于基因拷貝數(shù)(gene copy number)的計(jì)算(估算)方法，得到了抗生素抗性基因的基因拷貝數(shù)(圖 5).抗生素抗性基因在城市生活污水抗性基因拷貝數(shù)最高是others類(lèi)(包含多重耐藥基因、轉(zhuǎn)座子基因、整合子基因等)抗性基因，除此之外，氨基糖苷類(lèi)抗生素和四環(huán)素類(lèi)的抗性基因的基因拷貝數(shù)分別達(dá)到了1.4×108 copies ·L-1、 3.6×107 copies ·L-1.垃圾滲濾液中檢測(cè)到的39種抗性基因，分為4大類(lèi)，基因拷貝數(shù)最高的是氨基糖苷類(lèi)抗生素抗性基因，達(dá)到1.1×105 copies ·L-1，顯著低于生活污水中的抗性基因豐度(P < 0.05).
圖 5 城市生活污水和垃圾滲濾液抗生素抗性基因豐度
城市生活污水氮磷等營(yíng)養(yǎng)元素豐富，相對(duì)于垃圾滲濾液其有毒有害物質(zhì)濃度較低，微生物數(shù)量多，世代更新快，并且微生物種類(lèi)繁多等特性，兩者合并處理有一定優(yōu)勢(shì)[13].城市生活污水檢出富集的抗性基因總共有7大類(lèi)，其中119種抗生素抗性基因和可移動(dòng)元件顯著增加(P < 0.05)，富集倍數(shù)前三的基因是轉(zhuǎn)座子tnpA-04基因、 blaVEB和blaOXA10-01，分別達(dá)到了3 338、 1 061和1 001倍(圖 6)，表明轉(zhuǎn)座子基因和β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素抗性基因在城市生活污水中顯著富集.環(huán)境抗生素抗性基因在微生物中存在著水平基因轉(zhuǎn)移機(jī)制(horizontal gene transfer，HGT)，可移動(dòng)元件(MGEs)與總抗生素抗性存在線(xiàn)性相關(guān)[7]，可能是污水廠的進(jìn)水普遍有較高的檢出率和富集現(xiàn)象的原因之一.抗生素殘留和重金屬離子對(duì)抗生素抗性具有共選擇或者誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致了特定類(lèi)型的抗生素抗性基因的出現(xiàn)和富集[10, 29].城市生活污水和垃圾滲濾液都是人類(lèi)生產(chǎn)生活末端的“副產(chǎn)物”，含有一定量的抗生素殘留和重金屬離子，在分子機(jī)制上進(jìn)一步研究它們與抗生素抗性基因的關(guān)系，分析抗性基因在環(huán)境物質(zhì)脅迫下的演變傳播顯得十分必要.
圖 6 城市生活污水富集的抗生素抗性基因
雖然Wang等[25]和Wu等[26]的研究表明垃圾滲濾液可以檢測(cè)出四環(huán)素類(lèi)和磺胺類(lèi)等少量幾種抗生素抗性基因，但是本研究的結(jié)果表明垃圾滲濾液抗性基因豐度并不高，垃圾滲濾液可以跟城市生活污水合并處理，但是還需考慮高濃度抗生素殘留和重金屬等可能促進(jìn)城市生活污水抗生素抗性的潛在影響.此外，城市生活污水中高豐度和多類(lèi)型的抗生素抗性基因?qū)τ谌斯竦靥幚砩钗鬯忍幚矸绞娇赡軡撛诘纳鷳B(tài)環(huán)境安全風(fēng)險(xiǎn)也提供了新的考量和評(píng)價(jià)視角.
3 結(jié)論
(1) 垃圾滲濾液抗生素抗性基因豐度不高，可以接入城市生活污水廠合并處理，城市生活污水是環(huán)境抗生素抗性的一個(gè)重要存儲(chǔ)庫(kù).
(2) 抗生素抗性基因在城市生活污水和生活垃圾滲濾液中既有區(qū)別又有聯(lián)系，有著顯著不同的分布格局。(轉(zhuǎn)載自中國(guó)污水處理工程網(wǎng))
